バイオテクノロジー

認識配列を探して切断

制限酵素

認識配列は両鎖で対応します。5′・3′はDNA鎖の向き。切断後も塩基そのものは失われません。

右の断片

右のDNA断片を左へドラッグしてください。

粘着末端の塩基対形成と、DNAリガーゼによる糖・リン酸骨格の連結は別の過程です。平滑末端も連結できますが、突出した相補的塩基による対合はありません。

導入・選択・遺伝子発現には、宿主に適した発現調節配列など追加条件が必要です。導入すれば必ずタンパク質が作られるわけではありません。

考えてみよう　末端が近づくだけで、DNAの骨格までつながるだろうか？粘着末端と平滑末端の違いは？

初期DNA分子数 N₀ サイクル数 n：増幅効率：

1サイクル＝変性 → アニーリング → 伸長。分子図は代表的な1組を表示。

N = N₀ × (1 + e)ⁿ
理想値：N = N₀ × 2ⁿ

設定効率でのDNA量（期待値）

縦軸

青：理想効率100%　橙：設定効率。横軸はサイクル数、縦軸はDNA分子数。教育用の一定効率モデルであり、実際には効率の変化や頭打ちが起こります。端数は分子数の期待値です。

2ⁿは理想化した倍加モデルです。両端がプライマーで規定された長さの産物だけを、初回から厳密に数える式ではありません。

考えてみよう　効率80%と100%の差は、5回と30回でどう違う？対数目盛ではなぜ直線になる？

泳動の進行：

試料断片長さ：

と

緑：選んだ2試料で同じ長さ
橙：一方だけにある長さ
同じ長さでも同じ配列とは限りません。

Mはサイズマーカー。移動距離 d = t × [0.15 + 0.65 log₁₀(3000/L) / log₁₀(30)]（L：bp、t：進行率）。距離はゲル長に対する仮想値で、実験条件の予測には使えません。

シーケンシングなどで得た配列データを比較するモデルです。上の電気泳動だけでは、塩基配列そのものは直接読み取れません。

配列1 配列2

A・T・G・Cを入力（最大36塩基）。同じ位置で比較し、長さの違いは不一致に数えます。配列アラインメントは行いません。

考えてみよう　短い断片ほど遠くへ進むのはなぜ？バンドが同じ位置なら、塩基配列も同じといえる？

ガイドRNA PAM 修復経路

短縮した架空配列による概念図です。実在ゲノムのガイド設計ではありません。典型的なSpCas9のPAM（NGG）を例示しています。不一致時の切断を止める表示は簡略化で、実際には不一致があっても切断することがあります。

NHEJでは変化なく再結合する場合も、挿入・欠失が生じる場合もあります。HDRは鋳型配列を利用できる条件で起こります。経路や結果を自由に選べるという意味ではありません。ここでは結果例を順に示しています。

下の比較は、配列変化の影響を切り分けて調べる独立したモデルです。

変化の例

表示はDNAのコーディング鎖（5′→3′）。先頭のATGから3塩基ずつ読み、終止コドン以後は翻訳しません。実際の形質への影響は遺伝子・細胞・環境にも依存します。

植物 → 品種改良細胞 → 遺伝子の働きを調べる基礎研究疾患モデル → 医療研究

意図しない位置の編集（オフターゲット）や、標的位置での予想外の変化が起こり得ます。編集しても必ず目的の形質が得られるわけではありません。

安全性の検証、環境への影響、公平な利用、本人の同意などが課題です。次世代に受け継がれる編集は、将来の人々にも影響するため特に慎重な議論が必要です。

考えてみよう　1塩基の欠失と3塩基の欠失では、読み枠にどんな違いがある？ DNAが変化してもアミノ酸が変わらないのはなぜ？